La nitrogénase

Le complexe enzymatique de la nitrogénase, présent uniquement chez les procaryotes, est responsable de la fixation de l’azote moléculaire (Figure 1 ).

La nitrogénase est le complexe enzymatique qui catalyse la réaction

Ce complexe enzymatique est constitué de deux protéines : 1) la réductase qui, grâce à l'ATP modifie son potentiel redox et transmet alors des électrons à l'autre partie de l'enzyme et 2) la nitrogénase qui réduit l'azote moléculaire.

Le fonctionnement du complexe enzymatique qui est donc celui de réactions d'oxydoréduction ne peut se faire sans : 1) une alimentation en électrons et 2) un apport élevé en ATP.

De plus, l'activité de la nitrogénase est contrôlée non seulement par la concentration du milieu en NH₄ mais également par la concentration en oxygène dont les molécules peuvent endommager de manière irréversible l'enzyme, par oxydation des protéines enzymatiques. 

Etalonnage de la méthode du Taux de Réduction de l'Acétylène

F      Principe: La nitrogénase est étonnamment peu spécifique et catalyse la réduction de nombreux composés, en particulier l’acétylène. La production d’éthylène qui en découle est proportionnelle au taux d’azote moléculaire fixé. Le principe de la méthode consiste donc à incuber, en présence d’acétylène, les organismes susceptibles de fixer l’N₂ et de doser ensuite, par chromatographie en phase gazeuse, l’éthylène produit. Reste alors à déterminer le rapport “ acétylène réduit/N₂ fixé ”.

F      Limites : L’acétylène inhibe directement le métabolisme de certains groupes d’organismes tels les bactéries dénitrifiantes, méthanogènes, méthane-oxydantes, nitrifiantes, et également les bactéries fixatrices d’azote (Capone, 1983). Inversement, certaines cyanobactéries exposées à de l’acétylène montrent une activité accrue de leur nitrogénase (David et Fay, 1977) et les résultats de fixation cyanobactérienne obtenus peuvent être surestimés.

F      Expérimentation : L'eau de mer est prélevée à différentes profondeurs en utilisant une bouteille NISKIN avec les mêmes précautions que pour des mesures d'incorporation du ¹⁴C. Les incubations sont réalisées en utilisant des flacons en polycarbonates de 500 ou 1000 ml. Un volume d'air est laissé dans les flacons de façon à pouvoir remplacer quelques ml d'air par du C₂H₂. Les incubations ont lieu à la profondeur de prélèvement. A la fin de l'incubation, après équilibre de dissolution entre la phase liquide et gazeuse, 100 à 500 µl du mélange gazeux est injecté dans un chromatographe. Nous disposons d'un appareil fabriqué par l'Université de Sydney. C'est un chromatographe de terrain : son encombrement est faible, l’air (d’une bouteille de plongée) est utilisé comme gaz vecteur. Il a été conçu pour analyser plus spécialement l'acétylène, l'éthylène et l'hydrogène après séparation sur une colonne. . Il peut détecter de très faibles concentrations (1/500 000).

Etalonnage de la méthode du TRA

Pour pouvoir ramener les valeurs de taux de réduction de l’acétylène à des valeurs de fixation d’azote moléculaire, il faut étalonner la méthode. Pour cela, nous avons mis au point une méthode inspirée de celles de Seitzinger et Garber (1987) et Larkum et al. (1988). Les cyanobactéries concentrées ou non sont incubées en présence de C₂H₂ ou de ¹⁵N₂.

Les cyanobactéries sont récupérées par filtration. La quantité d'azote particulaire est mesurée sur la moitié du filtre (analyseur CHN) et l'autre moitié est passée au spectro de masse. Le % d’enrichissement est calculé par rapport au pourcentage naturel d’¹⁵N des échantillons des communautés étudiées non enrichis en ¹⁵N.

Compte tenu du fait que dans les flacons enrichis avec ¹⁵N₂, il reste du ¹⁴N dissous, il faut corriger les taux de fixation à partir du coefficient de dilution de N₂ et du pourcentage d’enrichissement en ¹⁵N (98 %).